MA-0807T001L/S 模基生物结直肠癌类器官培养基套装

模基生物结直肠癌类器官培养基套装

产品描述

模基生物结直肠癌类器官培养基套装是一种化学定义的细胞培养基，用于建立和维护人结直肠癌类器官。患者来源的癌症类器官概括了原始肿瘤的基因组和病理特征，因此在医学研究和精准医学方面具有巨大的前景。

产品信息

其他自备材料和试剂

MG&ABW基质胶

肿瘤组织消化液

红细胞裂解液

类器官消化液

类器官冷冻保存培养基(无血清)  

DPBS (1X)，液体，不含钙和镁  

FBS（胎牛血清）

EDTA

结直肠癌类器官完全培养基的制备

使用无菌操作技术配制结直肠癌类器官完全培养基。以下是准备 10mL 完全培养基的示例，如所需量不同，可相应调整用量。

1. 冰上解冻结直肠癌类器官培养因子B (50x)和结直肠癌类器官培养因子C(250x)。

注意： 解冻后，建议将结直肠癌类器官培养因子B (50x)和结直肠癌类器官培养因子C(250x)分别分装后保存取用，避免反复冻融。

2. 将 200uL结直肠癌类器官培养因子B (50x)，40uL 结直肠癌类器官培养因子C(250x) 加至9.76mL结直肠癌类器官培养基础培养基中，充分混合，配制成 10mL结直肠癌类器官完全培养基。

注意：配制后的结直肠癌类器官完全培养基可在 2-8°C 储存，建议在两周内使用。结直肠癌类器官培养因子B(50x)内含有细菌及真菌抗生素(50x)。

患者来源的结直肠癌类器官的原代培养

注意：涉及主要人体组织材料的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集主要人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

从初级组织中建立类器官

1.用离心管将原发性人结直肠癌组织碎片收集在冰冷的原发组织储存溶液中。将组织样品保持在4°C，直到分离开始。

2.评估获得的组织碎片是否完全由上皮组成。 如果存在脂肪或肌肉组织，请在解剖显微镜下使用手术剪刀或手术刀和镊子尽可能多地去除这些非上皮成分。如果没有脂肪或肌肉组织，请立即继续下一步。

3.用结直肠癌类器官基础培养基或DPBS冲洗组织两次。

4.使用手术剪刀或手术刀将组织切碎成1-3mm3的小碎片，置于细胞培养皿中。

5.在37°C下用10mL肿瘤组织消化溶液在15mL离心管中消化组织片段，消化时间可变，从30分钟到1.5小时不等。仔细监测消化过程，可适当吹打取上清观察消化程度。当大多数组织片段能够通过1mL移液器吸头时，消化过程即完成。

6.将FBS加入组织消化混合物中，最终浓度为2%，并使用100μm细胞过滤器过滤。

7.收集并在4°C下以250g离心过滤的细胞3分钟。  在可见的红色沉淀的情况下，吸入上清液，并使用2mL红细胞裂解液重悬沉淀，在室温下裂解红细胞1分钟，并在4°C下以250g离心3分钟。

8.吸出上清液并将沉淀重悬于基础培养基中，在4°C下以250g离心3分钟，再次重复此步骤。

9.吸出上清液并将沉淀重悬于基质胶中。基质胶应保存在冰上以防止其凝固。尽快进行该过程。使用的基质胶的量取决于颗粒的大小。大约10，000个细胞应接种在25 μ L基质胶中。

10.关键：不要过度稀释基质胶（基质胶应>70%（基质胶体积/总体积）），因为这可能会抑制固体液滴的正确形成。

将含有类器官的基质胶铺在24孔细胞培养板的底部，每个液滴围绕孔中心约30 μ L。

关键：一旦类器官重悬于基质胶中，尽快进行种板，因为基质胶可能会在试管或移液器吸头中凝固。不要让基质颗粒接触管壁。

11.将培养板放入37°C和5%CO ₂的培养箱中15-25分钟，让基质凝胶固化。

12.准备所需量的结直肠癌类器官完全培养基。

13.一旦基质胶滴凝固（15-25分钟），打开板并小心地向每个孔中加入500 μ L结直肠癌类器官完全培养基。

关键：不要将培养基直接添加到基质胶液滴的顶部，因为这可能会破坏已凝固结构。

14.将培养板置于37°C和5%CO ₂的恒温培养箱中。

15.每隔3-4天更换一次培养基，小心地从孔中吸出培养基，并用新鲜的预热的类器官完全培养基代替它。

16.密切监测类器官生长状态，理想情况下，结直肠癌类器官应在 7 至 10 天内建成。

结直肠癌类器官的传代培养

1、以下操作吹打细胞的吸头均需用润洗液润洗后使用：

类器官收集：待结直肠癌类器官培养到直径为200~500μm大小时（或变黑不再增大时），即可进行结直肠癌类器官的传代（每代约5天左右）。吸弃旧培养基，加入等体积基础培养基，用细胞刮刀或者移液管吸头尖端轻轻刮下（或吹打）细胞外基质和结直肠癌类器官混合物，转移至1.5ml或15ml离心管中，吹打5~10次，使结直肠癌类器官和细胞外基质分离，300g离心3分钟。

2、类器官消化及清洗：弃上清，加入1mL基础培养基吹打类器官5~10次，取少量悬液镜检观察类器官状态：

若类器官已分散成碎片则可选择机械吹打分散类器官后直接300g离心3分钟，离心后用PBS或基础培养基清洗2次。

若类器官比较完整可300g离心3分钟，弃上清，加入5倍于细胞外基质和结直肠癌类器官混合物体积的类器官消化液，吹打混匀后置于37℃培养箱中消化2分钟。加入5倍于消化液体积的基础培养基终止消化。离心后用PBS或基础培养基清洗2次。

3、基质胶3D包裹：清洗完成后将离心沉淀中的细胞进行传代培养，在细胞沉淀中加入细胞外基质（>70%）并在冰上混匀（注意，混匀吹打的动作要轻柔，切忌产生大量气泡，常温混匀则需要控制在15秒内），混匀后置于冰上。

4、种板培养：用移液器吸去细胞外基质和细胞的混合液移至培养板孔中，（如24孔细胞培养板每孔点20~30μL混合悬液），混合悬液须点在培养孔底部中央位置，其铺开后不可接触培养孔侧壁。将培养本放入37℃，在5%二氧化碳细胞培养箱中孵育15分钟，待细胞外基质凝固至不再流动后，沿孔壁缓缓加入完全培养基（以24孔为例，加500μL完全培养基），每3~4天更换一次完全培养基。

5、持续培养：将细胞培养板放入培养箱中进行培养，每1天于倒置显微镜下观察结直肠癌类器官的生长状态，每3天于倒置显微镜下拍照，记录多个视野中的结直肠癌类器官的形态和分布。