MA-0817H001L/S 模基生物人结直肠类器官培养培养基套装

模基生物人结直肠类器官培养基套装

产品描述

厦门模基生物人结直肠类器官培养基套装是一种化学定义的细胞培养基，用于建立和培养成人干细胞衍生的人结肠类器官。 通过位于隐窝的干细胞及其祖细胞的增殖来驱动结肠上皮细胞的自我更新，使人类结肠类器官显示出所有的特征。在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面，结肠上皮的影响很大。人类结肠发育和疾病的研究前景是前所未有的，人类结肠类器官也可能应用于再生生物学中的结肠上皮的体外扩张。

产品信息

其他自备材料和试剂

ABW &模基生物基质胶

上皮类器官基础培养基  

类器官消化液  

润洗液

类器官冷冻保存培养基(无血清)  

DPBS (1X)，液体，不含钙和镁  

胎牛血清(FBS)  

EDTA 

人结直肠类器官扩增培养基和稳态培养基的制备

采用无菌技术制备人结肠类器官扩增培养基和稳态培养基。在人结肠类器官扩增培养基中生长的类结肠器官绝大多数由LGR5干细胞，循环转运扩增(TA)细胞，早期肠细胞和少量杯状细胞组成。在人结肠类器官稳态培养基中生长的类结肠器官含有LGR5干细胞、TA细胞、早期和成熟肠细胞、杯状细胞、M细胞和肠内分泌细胞，以及少量簇状细胞。

以下是准备 10mL 完全培养基的示例，如所需量不同，可相应调整用量。

1.冰上解冻人结直肠类器官培养因子B、人结直肠类器官培养因子C、人结直肠类器官培养因子D。

注意： 解冻后，建议将人结直肠类器官培养因子B、人结直肠类器官培养因子C、人结直肠类器官培养因子D分别分装后保存取用，避免反复冻融。

2. 配制人结肠类器官扩增培养基，专门用于原代培养和复苏。添加200 μL人结直肠类器官培养因子B (50x)、40 μL人结直肠类器官培养因子C (250x)、40 μL人结直肠类器官培养因子D (250x)、至9.72 mL人结肠类器官基础培养基中，混合均匀。

3.配制人结肠类器官扩增培养基，专门用于培养传代。添加200 μL人结直肠类器官培养因子B (50x)、40 μL人结直肠类器官培养因子C (250x)至9.76 mL人结肠类器官基础培养基中，混合均匀。

注意：配制后的人结肠类器官扩增培养基和稳态培养基可在 2-8°C 储存，建议在两周内使用。人结肠类器官培养因子B(50x)内含有细菌及真菌抗生素(50x)。

人结肠类器官的原代建立

注意：涉及主要人体组织材料的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集主要人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

从初级组织中建立类器官

1. 使用离心管将原代人结肠组织收集在冰冷的原代组织储存液中，将组织样本保存在4°C，直到开始分离。

2. 评估获得的组织碎片是否完全由上皮组织组成。如果存在脂肪或肌肉组织，请在解剖显微镜下使用手术剪刀或手术刀和镊子尽可能多地去除这些非上皮成分。如果没有脂肪或肌肉组织，请立即继续下一步。

3.用上皮类器官基础培养基或DPBS冲洗结肠组织，直到上清澄清。

4. 在腺窝结构分离之前，将基质胶解冻并保持低温。加入5 mL FBS至45 mL上皮类器官基础培养基中制备10%FBS培养基。

5. 将组织在细胞培养皿中使用外科剪刀或手术刀切成5mm³的小碎片。

注：分离的样品必须足够小，能够通过10ml移液管的尖端。

6.将分离的样品放入一个15毫升的离心管中，管中含有10ml预冷的DPBS。

7.用10ml移液管清洗样品至少10次。

注：在接下来的步骤中，使用10%FBS培养基润洗10ml移液管的内表面以避免样品粘在移液管壁上。

8.让管子静止不动，直到样品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清液，加入10mL预冷DPBS。

9. 重复步骤7和8 3-5次，直到上清完全清澈。

注：彻底清洗样品是避免细菌污染的关键。

10. 向试管中加入10ml预冷DPBS，并加入2.5 mM EDTA 。把管子放在摇床上，在4°C的温度下轻轻摇动40分钟。

11. 用EDTA处理后，保持试管静止，直到样品沉淀到试管底部，然后用10ml移液管取上清液，加入10ml预冷DPBS。

12. 让管子静止不动，直到样品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清。

13. 加入10ml预冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。隐窝结构会通过移液吸头释放到上清液中。将含有分离的隐窝的上清液放入新的15ml管中。

14. 加入10ml预冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。允许组织碎片在正常重力下下沉至少30秒钟。隐窝被通过移液释放到上清液中。将含有分离的隐窝的上清液放入一个新的15ml管中。

15. 在4℃、400g条件下离心3分钟。吸出并丢弃上清。

16. 将沉淀重悬在1ml DPBS中，并将隐窝悬浮液转移到新的1.5 mL管中。滴20 μL隐窝重悬液到培养皿中。在立体显微镜下计数隐窝的数量并计算隐窝的总数。

17. 在4℃、400g条件下离心3分钟。吸出并丢弃上清。

18. 吸取上清，将沉淀重悬于基质胶中。基质胶应保存在冰上以防止固化。推荐重悬密度为每 25 μL基质胶悬液包含 100 - 500 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中 基质胶 的结构稳定性。

19. 将基质胶和组织细胞小心均匀混合以防止气泡产生并将悬液加入 24 孔板，30 μL每孔滴加在孔底中心，避免

悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

20. 将接种完成后的培养板置于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15 -25min 左右待基质胶凝固后取出。

21. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前预热的人结肠类器官扩增培养基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 无菌水， 置于 37℃温箱、5% CO2条件下培养。

注意：请沿孔壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。