MA-0817H003L/S 模基生物人胃上皮类器官培养基套装

模基生物人胃上皮类器官试培养基套装

产品描述

厦门模基生物人胃上皮类器官培养基套装是一种化学定义的细胞培养基，用于建立和培养来自成体干细胞的人胃上皮类器官。胃上皮细胞的自我更新是由干细胞及其祖细胞的增殖所驱动的。人的胃上皮类器官具有所有的特征，包括在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面，因此能用于对人类胃上皮内稳态和疾病的研究。

产品信息

其他自备材料和试剂

MG&ABW基质胶

上皮类器官基础培养基  

类器官消化液  

润洗液

类器官冷冻保存培养基(无血清)  

DPBS (1X)，液体，不含钙和镁  

胎牛血清(FBS)  

EDTA 

人胃上皮类器官原代培养培养基和稳态培养基的制备

采用无菌技术制备人胃上皮类器官原代培养培养基和稳态培养基的制备。在人胃上皮类器官稳态培养基中生长的胃上皮类器官绝大多数由LGR5+干细胞，抗粘膜细胞、腺粘膜细胞、主细胞，以及少量肠内分泌细胞组成。

以下是准备 10mL原代培养培养基和稳态培养基的示例，如所需量不同，可相应调整用量。

1.冰上解冻人胃上皮类器官培养因子B、人胃上皮类器官培养因子C、人胃上皮类器官培养因子D。

注意： 解冻后，建议将人胃上皮类器官培养因子B、人胃上皮类器官培养因子C、人胃上皮类器官培养因子D分别分装后保存取用，避免反复冻融。

2. 配制人胃上皮类器官原代培养培养基，专门用于原代培养和复苏。添加200 μL人胃上皮类器官培养因子B (50x)、40 μL人胃上皮类器官培养因子C (250x)、40 μL人胃上皮类器官培养因子D (250x)、至9.72 mL人胃上皮类器官基础培养基中，混合均匀。

3.配制人胃上皮类器官稳态培养基，专门用于培养传代。添加200 μL人胃上皮类器官培养因子B (50x)、40 μL人胃上皮类器官培养因子C (250x)至9.76 mL人胃上皮类器官基础培养基中，混合均匀。

注意：配制后的人胃上皮类器官原代培养培养基和稳态培养基可在 2-8°C 储存，建议在两周内使用。人胃上皮类器官培养因子B(50x)内含有细菌及真菌抗生素(50x)。

人胃上皮类器官的原代建立

注意：涉及主要人体组织材料的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集主要人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

从初级组织中建立类器官

1. 使用离心管收集1-2 cm²原代人胃上皮组织收集在冰冷的原代组织储存液中，将组织样本保存在4°C，直到开始分离。

2. 评估获得的组织碎片是否完全由上皮组织组成。如果存在脂肪或肌肉组织，请在解剖显微镜下使用手术剪刀或手术刀和镊子尽可能多地去除这些非上皮成分。如果没有脂肪或肌肉组织，请立即继续下一步。

3.用上皮类器官基础培养基或DPBS冲洗结人胃上皮组织，直到上清澄清。

4. 在腺窝结构分离之前，将基质胶解冻并保持低温。加入5 mL FBS至45 mL上皮类器官基础培养基中制备10%FBS培养基。

5. 将组织在细胞培养皿中使用外科剪刀或手术刀切成5mm³的小碎片。

注：分离的样品必须足够小，能够通过10ml移液管的尖端。

6.将分离的样品放入一个15毫升的离心管中，管中含有10ml预冷的DPBS。

7.用10ml移液管清洗样品至少10次。

注：在接下来的步骤中，使用10%FBS培养基润洗10ml移液管的内表面以避免样品粘在移液管壁上。

8.让管子静止不动，直到样品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清液，加入10mL预冷DPBS。

9. 重复步骤7和8 3-5次，直到上清完全清澈。

注：彻底清洗样品是避免细菌污染的关键。

10. 向试管中加入10ml预冷DPBS，并加入2.5 mM EDTA 。把管子放在摇床上，在4°C的温度下轻轻摇动40分钟。

11. 用EDTA处理后，保持试管静止，直到样品沉淀到试管底部，然后用10ml移液管取上清液，加入10ml预冷DPBS。

12. 让管子静止不动，直到样品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清。

13. 加入10ml预冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。隐窝结构会通过移液吸头释放到上清液中。将含有分离的隐窝的上清液放入新的15ml管中。

14. 加入10ml预冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。允许组织碎片在正常重力下下沉至少30秒钟。隐窝被通过移液释放到上清液中。将含有分离的隐窝的上清液放入一个新的15ml管中。

15. 在4℃、400g条件下离心3分钟。吸出并丢弃上清。

16. 将沉淀重悬在1ml DPBS中，并将隐窝悬浮液转移到新的1.5 mL管中。滴20 μL隐窝重悬液到培养皿中。在立体显微镜下计数隐窝的数量并计算隐窝的总数。

17. 在4℃、400g条件下离心3分钟。吸出并丢弃上清。

18. 吸取上清，将沉淀重悬于基质胶中。基质胶应保存在冰上以防止固化。推荐重悬密度为每 25 μL基质胶悬液包含 100 - 500 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中 基质胶 的结构稳定性。

19. 将基质胶和组织细胞小心均匀混合以防止气泡产生并将悬液加入 24 孔板，30 μL每孔滴加在孔底中心，避免

悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

20. 将接种完成后的培养板置于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15 -25min 左右待基质胶凝固后取出。

21. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前预热的人胃上皮类器官原代培养基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 无菌水， 置于 37℃温箱、5% CO2条件下培养。

注意：请沿孔壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

22. 每 3 d 更换一次培养基，从孔中小心地吸出培养基，并用新鲜的、预热过的有机完全培养基替换，更换培养基时应避免破坏基质胶。

23. 密切监测类器官生长状态，理想情况下人类胃上皮类器官应在 5 - 8 天内建成。

人胃上皮类器官的传代培养

1.用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过润洗的 1.5 mL EP 管中。

2.用经过润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。

3. 300×g，室温，离心 3 min，弃上清。用机械破坏或类器官消化液消化分离类器官。机械破坏时，将类器官悬液重悬在1 mL上皮类器官基础培养基中吹打混匀。使用消化液时，用经过润洗的枪头加入 200 μL 类器官消化液并充分混匀，37℃条件下消化 1 - 3 min，消化结束后加入 1 mL上皮类器官基础培养基吹打混匀。密切监视消化过程，尽可能缩短类器官在消化液中的时间。

 警告：不要在类器官解离液中解离5分钟，因为这可能会导致较差的类器官的生长甚至破坏。根据经验，如果是小块细胞的混合物，可以观察到由10-50个细胞组成的细胞团，消化就完成了。

4. 300×g，室温，离心 3 min，弃上清，再次加入 1 mL上皮类器官基础培养基并混匀。

5. 300×g，室温，再次离心 3min，弃上清后置于冰上。

6. 用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔 30 μL 左右。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

8. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15 min 左右待基质胶凝固后取出。

9. 配制人胃上皮类器官稳态培养基。

10. 待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的人胃上皮类器官稳态培养基，24 孔板每孔 500 μL。

11. 将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，直到类器官需要进一步的实验。