MA-0817H004L/S 模基生物人气管类器官培养基套装

模基生物人气管类器官培养基套装

产品描述

厦门模基生物人气管类器官培养基套装是一种化学定义的细胞培养基，用于建立和维持来自人类气管干细胞的人气管类器官。气管的自我更新上皮细胞是由基底细胞的增殖驱动的。人气管类器官包含基底细胞、纤毛细胞、分泌细胞和少量神经内分泌细胞，因此类器官显示了气管的所有特征。因此，上皮细胞在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面具有很大的应用前景，可用于气管稳态与疾病的研究。

产品信息

其他自备材料和试剂

MG&ABW基质胶

组织消化液

上皮类器官基础培养基

红细胞裂解液

类器官消化液

润洗液

类器官冷冻保存培养基(无血清)  

DPBS (1X)，液体，不含钙和镁  

人气管类器官完全培养基的制备

使用无菌操作技术配制人气管类器官完全培养基。以下是准备 10mL 完全培养基的示例，如所需量不同，可相应调整

用量。

1. 冰上解冻 Human Airway Organoid Supplement B (50x)和 Human Airway Organoid Supplement C (250x)。

注意： 解冻后，建议将 Human Airway Organoid Supplement B (50x)和 Human Airway Organoid Supplement C (250x)

分别分装后保存取用，避免反复冻融。

2. 将 200uL Human Airway Organoid Supplement B (50x)，40uL Human Airway Organoid Supplement C (250x) 加至

9.76mL Human Airway Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 人气管类器官完全培养基。

注意：配制后的人气管类器官完全培养基可在 2-8°C 储存，建议在两周内使用。Human Airway Organoid Supplement

B(50x)内含有细菌及真菌抗生素(50x)。

人气管类器官原代培养

注意:涉及初级人体组织材料的研究必须遵循所有相关机构和政府的规定规定。在采集原始人体组织之前，必须获得所有受试者的知情同意。

从原始组织中建立类器官

1.收集经活检或手术获得的原代人气管组织块，保存在冰冷的原代组织库中溶液于离心管中。将组织样本保存在4°C，直到开始分离。

2.评估获得的组织片是否纯由上皮组织组成，或是否也包含脂肪或肌肉组织。如果是这样，尽可能在解剖显微镜下使用外科剪刀或手术刀和镊子去除非上皮性成分。如果没有脂肪或肌肉组织，立即继续下一步。

3.用上皮类器官基础培养基或DPBS冲洗气管组织两次。

4.将组织在细胞培养皿中使用外科剪刀或手术刀切成1-3毫米的小碎片。

5.用10mL组织消化液在15mL离心管中37°C消化组织碎片，孵育时间从30min到1h不等。仔细监测消化过程，每5-10分钟通过剧烈摇动或反复吹吸移液来混合液体。当大多数组织碎片能够通过1mL移液管尖端时，消化过程即完成。

6. 将FBS加入组织消化液中，最终浓度为2%，用100 μm细胞筛过滤。

7. 收集过滤后的细胞，在4℃下250g离心3分钟。如发现明显的红色颗粒，抽吸上清，用2mL红细胞裂解液重悬，红细胞在室温下静置1分钟，然后在4℃下250g离心3分钟。

8. 弃去上清液，将细胞悬液重悬于上皮类器官基础培养基，在4℃下250g离心3分钟。再次重复此步骤。

9. 弃去上清液，将细胞悬液重悬于基质胶中。基质胶应该保存在冰上以防止固化，此步骤应尽快完成。基质的用量取决于基质的大小，推荐重悬密度为每 10uL基质胶悬液包含大约10,000个细胞。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

10. 将基质胶和组织细胞的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，每孔 30uL 左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

11. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15min 左右待基质胶凝固。

12. 准备所需量的人气管类器官完全培养基。

13.待基质胶完全凝固后，加入已配制好的人气管类器官完全培养基，24 孔板每孔 500uL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

14. 将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。

15. 每 3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。

16. 密切监测类器官生长状态，理想情况下，人气管类器官应在 7 至 10 天内建成。 

人气管类器官传代培养

1. 用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经 过润洗液润洗的 1.5mL EP 管中。

2. 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，使得类器官与基质胶分离。

3.250g 离心力室温离心 3min。

4.弃上清，使用类器官消化液或用机械破坏。对于使用类器官消化液的细胞解离，在类器官消化液中重悬类器官悬浮液，移液器反复上下吹打并置于37°C孵育，直至类器官解离。使用带滤芯移液头每2分钟反复上下吹吸8次，以帮助破坏类器官。密切监视消化过程使在类器官解离液中的孵育时间最短。如发生机械故障，在1.5 mL上皮类器官基础培养基中重悬类器官悬液。小心地用移液管吸取类器官悬浮液，反复上下30次，这将有助于消化。

警告:不要在类器官解离液中解离5分钟，因为这可能会导致较差的类器官的生长甚至破坏。根据经验，如果是小块细胞的混合物，可以观察到由10-50个细胞组成的细胞团，消化就完成了。

5. 消化完成后，用1ml上皮类器官基础培养基进行一次冲洗，然后室温下250g离心3分钟。

6. 弃上清，用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔 30uL 左右。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

8. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15min 左右待基质胶凝固。

9. 配制人气管类器官完全培养基。

10. 待基质胶完全凝固后，加入已配制好的人气管类器官完全培养基，24 孔板每孔 500uL。

11. 将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，直到类器官需要进一步的实验。