Transwell 实验——基本操作

Transwell实验——基本操作

一、基本原理：

Transwell小室在培养板中，小室内称上室，小室放入的培养板称下室，上室底部为一层聚碳酸酯膜，这层膜具有通透性，将上室培养液和含下室培养液隔开，下室中的培养液可以影响上室中的细胞，从而研究下室中液体对细胞的生长、迁移的影响，细胞接种到低营养的培养液里，通常膜孔都被ABW^@Matrigengel覆盖，模仿细胞外基质，肿瘤细胞必须分泌水解酶并通过变形运动才能穿过铺有ABW^@Matrigengel的滤膜，计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

 

二、实验仪器和材料  

细胞：SGC-7901

培养基：1640基础培养基，含10%ABW胎牛血清的1640完全培养基（ABW血清货号：AB20214403）

耗材：预冷枪头、预冷1.5毫升离心管和放有8微升Transwell小室的预冷24孔板

其他：胰酶，PBS，0.1%结晶紫染液，4％多聚甲醛，Matrigengel（ABW货号：0827045）

 

三、实验步骤

 

A.配培养基：5毫升ABW胎牛血清+500微升双抗+44.5毫升1640基础培养基混匀于50毫升离心管。

 

B.准备基质胶

1.在冰上4℃过夜融化Matrigengel，实验前转移到冰盒中。（注意：准备-20℃预冷的枪头用于吸取Matrigengel）

2.将枪头、1.5毫升离心管、放有Transwell小室的24孔板和1640基础培养基放入冰盒中预冷。

 

C.基质胶铺板（冰上操作）

1.稀释Matrigengel：先将8微升 Matrigenge加入预冷的1.5毫升离心管中，然后加入64微升预冷的1640基础培养基，并用枪头吹打充分混匀。（Matrigenge和基础培养基以1:8的比例稀释）

2.吸取60微升稀释后的Matrigengel，垂直加入Transwewll上室中，均匀平铺在底部。另吸取60微升1640基础培养基于小室中，作为空白对照。放入培养箱（37℃，5%CO₂)中孵育3h，使Matrigengel聚合成薄膜。（注意：铺胶过程不要产生气泡，均匀铺胶。）

3.孵育后将上室中多余液体吸掉，在每孔中加入100微升1640基础培养基后，于培养箱放置30 分钟，进行基底膜水化。

4. 将上室中多余液体吸掉，准备接种细胞。

 

D.制作细胞悬液

1.制作细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。（此步骤可选择操作，如果细胞迁移能力不强，可考虑进行此步骤增加血清对细胞的诱导。）

2.取汇合度达70%-80%的细胞进行消化并离心弃废液，然后用1640基础培养基重悬细胞，计数后调整细胞密度至每孔5万个。（可根据不同细胞系Transwell迁移实验的细胞密度进行调整。）

 

E.接种细胞

1.在24孔板下室加入500微升含10%ABW胎牛血清的1640完全培养基。然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内（注意：下层培养液和小室间经常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。）

2.每孔加入200微升细胞悬液到Transwell上室中。

3.培养箱培养24h后可进行固定染色。（时间点可根据肿瘤细胞侵袭能力而定，一般24-48h，还需要考虑细胞状态和消化时间对细胞的影响。另外建议最好接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确保没有大气泡产生。）

 

F.细胞固定

1.取出Transwell小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigengel和上室内的细胞。

2.在24孔板干净的孔中加入4％多聚甲醛600微升，将小室放入后固定20-30分钟。

 

G.细胞染色及计数

1.弃去固定液，将小室在盛有PBS的6厘米皿中涮洗1遍。（注意避免触碰到小室底部）

2.用0.1%结晶紫染色5-10分钟，PBS涮洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。

3.适当风干后，在10倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。