成管实验三：铺细胞量多少最合适

成管实验三铺细胞量多少最合适

一、实验材料

细胞：人脐静脉内皮细胞

培养基：ECM专用培养基、含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培养基、DMEM基础培养基

耗材：预冷枪头、预冷 96 孔板和预冷1.5毫升离心管

其他：胰酶，PBS，Matrigengel（ABW货号：0827045/0827065，金牌基质胶）

二、实验步骤

A.实验准备

1.实验过程中所需耗材包括但不限于：10微升、200微升、1毫升移液枪枪头；冻存管或1.5毫升离心管；小镊子。耗材需要高压灭菌并烘干后置于-20℃-4℃环境中预冷。

2.提前打开制冰机，用冰盒装满冰。

3.提前24小时将基质胶放置在冰盒里，并将冰盒置于4℃冰箱，在此期间尽量减少开关冰箱门。

B.准备基质胶

1.实验前将基质胶、枪头、1.5毫升离心管和96孔板置于冰盒中预冷。

C.铺基质胶

1.取1.5毫升离心管，按以下比例配基质胶。

240微升原胶+120微升 DMEM基础培养基

2.混匀基质胶后，在96孔板中按照每孔50微升的量加入，避免产生气泡。（注：可以将枪头剪短前端，移液器打到一档比较不容易出现气泡。若是有气泡，可以对准气泡，用枪将气泡吸上来或者戳破气泡。配胶时可以按比例多配一点，不要刚好每孔配50微升。）

3.在37℃ 5%二氧化碳培养箱中放置1小时。

D.铺细胞

1.弃上清：当人脐静脉内皮细胞在培养皿中生长至70~80%时，吸去培养液上清。

2.清洗：用1毫升PBS清洗悬浮死细胞。

3.消化：用胰酶消化下来，用含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化（10厘米皿用1毫升胰酶，1毫升含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，6厘米皿用500微升胰酶，500微升含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化。）

4.离心：转移至1.5毫升离心管，1200转数，5分钟离心。

5.用1毫升ECM专用培养基重悬。

6.计数：吸取10微升于计数板，用细胞计数仪进行计数，调整细胞密度为10000个细胞/孔、30000个细胞/孔、50000个细胞/孔

7.按照每孔加入50微升重悬液加入凝胶好的96孔板中。

8.在5％二氧化碳37℃培养箱孵育4小时、24小时。

E.观察结果，拍照。